PCR یا واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، روشی مولکولی برای تکثیر هدفمند یک قطعه مشخص از DNA است. این روش با استفاده از پرایمر، آنزیم DNA پلیمراز، نوکلئوتیدها و چرخه‌های حرارتی انجام می‌شود.

Real-Time PCR روشی است که در آن تکثیر ماده ژنتیکی و تولید سیگنال فلورسنت به‌صورت هم‌زمان و در طول چرخه‌های واکنش پایش می‌شود. این روش برای تشخیص و اندازه‌گیری مقدار DNA یا RNA هدف کاربرد دارد.

در PCR معمولی، محصول واکنش معمولاً پس از پایان تکثیر با روش‌هایی مانند الکتروفورز بررسی می‌شود. در Real-Time PCR، سیگنال فلورسنت در زمان انجام واکنش ثبت می‌شود و امکان تحلیل کمی و کیفی ماده ژنتیکی فراهم می‌گردد.

ترموسایکلر دمای نمونه‌ها را طبق برنامه مشخص تغییر می‌دهد و چرخه‌های دناتوراسیون، اتصال پرایمر و طویل‌سازی را اجرا می‌کند. این دستگاه برای انجام PCR معمولی و در برخی مدل‌ها برای آزمایش‌های مرتبط با Real-Time PCR استفاده می‌شود.

این دستگاه معمولاً شامل بلوک حرارتی، سیستم کنترل دما، منبع نور، فیلترهای نوری، آشکارساز فلورسانس، درپوش گرم‌شونده، نرم‌افزار تحلیل داده و سامانه ثبت نتایج است.

PCR برای شناسایی عوامل بیماری‌زا، بررسی جهش‌های ژنتیکی، شناسایی توالی‌های DNA، تأیید نتایج کشت، ژنوتایپینگ، تحقیقات زیست‌شناسی مولکولی و کنترل کیفیت محصولات زیستی استفاده می‌شود.

Real-Time PCR در تشخیص ویروس‌ها و باکتری‌ها، سنجش بار ویروسی، اندازه‌گیری بیان ژن، شناسایی جهش‌ها، تعیین مقدار DNA و RNA و برخی آزمایش‌های تحقیقاتی و تشخیصی کاربرد دارد.

برای شناسایی RNA معمولاً ابتدا RNA به DNA مکمل یا cDNA تبدیل می‌شود. این مرحله با آنزیم رونوشت‌بردار معکوس انجام می‌شود و سپس cDNA حاصل با PCR یا Real-Time PCR تکثیر و شناسایی می‌گردد.

RT-PCR می‌تواند به تبدیل RNA به cDNA با استفاده از رونوشت‌برداری معکوس اشاره کند، در حالی که Real-Time PCR به پایش فلورسنت واکنش در زمان واقعی مربوط است. در برخی آزمایش‌ها هر دو فرایند با هم انجام می‌شوند که به آن RT-qPCR گفته می‌شود.

مراحل اصلی PCR شامل دناتوراسیون برای جدا کردن دو رشته DNA، اتصال پرایمر به توالی هدف و طویل‌سازی رشته جدید توسط DNA پلیمراز است. این مراحل در چندین چرخه تکرار می‌شوند.

پرایمر قطعه کوتاهی از DNA است که به ناحیه مکمل در دو طرف توالی هدف متصل می‌شود. پرایمر محل شروع فعالیت DNA پلیمراز را فراهم می‌کند و اختصاصیت واکنش PCR تا حد زیادی به طراحی صحیح آن وابسته است.

پروب فلورسنت توالی کوتاهی است که به بخش مشخصی از محصول PCR متصل می‌شود. هنگام تکثیر هدف، سیگنال فلورسنت ایجاد یا آزاد می‌شود و دستگاه از این سیگنال برای تشخیص یا اندازه‌گیری محصول استفاده می‌کند.

مسترمیکس محلولی آماده یا نیمه‌آماده است که معمولاً شامل DNA پلیمراز، بافر، یون‌های منیزیم و نوکلئوتیدهاست. استفاده از مسترمیکس تعداد مراحل آماده‌سازی را کاهش داده و یکنواختی واکنش‌ها را افزایش می‌دهد.

Ct یا Cq چرخه‌ای است که در آن سیگنال فلورسنت از آستانه مشخص عبور می‌کند. به‌طور کلی، مقدار کمتر Ct نشان‌دهنده مقدار اولیه بیشتر از ماده ژنتیکی هدف است، اما تفسیر نهایی باید بر اساس کیت، کنترل‌ها و روش اعتبارسنجی انجام شود.

خیر. مقایسه Ct فقط زمانی معتبر است که شرایط آزمایش، کیت، دستگاه، روش استخراج، کنترل‌ها و هدف ژنتیکی یکسان یا به‌درستی استاندارد شده باشند. Ct به‌تنهایی نباید بدون توجه به روش آزمایش تفسیر شود.

منحنی استاندارد رابطه میان مقدار شناخته‌شده ماده ژنتیکی و مقدار Ct را نشان می‌دهد. از این منحنی می‌توان برای محاسبه غلظت نمونه‌های ناشناخته و ارزیابی بازده واکنش استفاده کرد.

کنترل مثبت حاوی ماده ژنتیکی هدف یا ماده کنترل شناخته‌شده است. ایجاد نتیجه مورد انتظار در این کنترل نشان می‌دهد که معرف‌ها، برنامه دستگاه و مراحل اصلی واکنش عملکرد مناسبی دارند.

کنترل منفی فاقد ماده ژنتیکی هدف است و برای بررسی آلودگی معرف‌ها یا محیط کار استفاده می‌شود. مشاهده سیگنال هدف در کنترل منفی می‌تواند نشانه آلودگی و بی‌اعتباری بخشی از آزمایش باشد.

کنترل استخراج به‌منظور بررسی عملکرد فرایند استخراج و احتمال آلودگی در مرحله استخراج استفاده می‌شود. این کنترل می‌تواند به شناسایی خطاهایی کمک کند که در کنترل‌های صرفاً مربوط به واکنش PCR دیده نمی‌شوند.

محصولات قبلی PCR، پیپت‌ها، سطوح کاری، دستکش، معرف‌های آلوده، جابه‌جایی نادرست نمونه و جریان نامناسب کار از منابع رایج آلودگی هستند. جداسازی نواحی پیش‌PCR و پس‌PCR و استفاده از فیلتر نوک سمپلر به کاهش آلودگی کمک می‌کند.

استفاده از محیط‌های جداگانه برای آماده‌سازی واکنش و تحلیل محصول، تعویض منظم دستکش، ضدعفونی سطوح، استفاده از نوک‌های فیلتر‌دار، کنترل جریان کار و خودداری از باز کردن محصولات PCR در ناحیه پیش‌PCR از اقدامات مؤثر برای کنترل آلودگی هستند.

بله. دستگاه باید طبق دستورالعمل سازنده و برنامه کنترل کیفیت آزمایشگاه بررسی و کالیبره شود. کنترل دمای بلوک، صحت عملکرد سیستم اپتیکی و بررسی یکنواختی چاهک‌ها از بخش‌های مهم ارزیابی دستگاه هستند.

نگهداری دستگاه شامل تمیز کردن سطح و بلوک طبق دستورالعمل سازنده، بررسی درپوش و کابل‌ها، کنترل عملکرد نرم‌افزار، جلوگیری از ورود مایعات به دستگاه و انجام سرویس‌های دوره‌ای توسط کارشناس مجاز است.

خیر. سازگاری کیت با دستگاه، نوع تیوب یا پلیت، حجم واکنش، کانال‌های فلورسنت، برنامه حرارتی و نرم‌افزار باید بررسی شود. استفاده از کیت ناسازگار می‌تواند باعث نتایج نادرست یا کاهش عملکرد آزمایش شود.

دستگاه تک‌کاناله معمولاً یک هدف یا یک رنگ فلورسنت را در هر واکنش بررسی می‌کند. دستگاه چندکاناله می‌تواند چند رنگ و چند هدف را به‌صورت هم‌زمان شناسایی کند و برای آزمایش‌های مالتی‌پلکس مناسب‌تر است.

PCR مالتی‌پلکس روشی است که در آن چند هدف ژنتیکی در یک واکنش بررسی می‌شوند. این روش در صورت طراحی صحیح پرایمرها و بهینه‌سازی شرایط، موجب صرفه‌جویی در زمان و مواد مصرفی می‌شود.

بازده واکنش نشان می‌دهد که تکثیر ماده ژنتیکی در هر چرخه تا چه اندازه مؤثر انجام می‌شود. بازده نامناسب می‌تواند ناشی از طراحی ضعیف پرایمر، مهارکننده‌های نمونه، کیفیت پایین استخراج یا شرایط نامناسب واکنش باشد.

مقدار کم ماده ژنتیکی، تخریب DNA یا RNA، استخراج نامناسب، وجود مواد مهارکننده، طراحی نادرست پرایمر، خطای پیپتاژ، انتخاب نادرست نمونه و تنظیم نامناسب برنامه حرارتی می‌توانند موجب نتیجه منفی کاذب شوند.

آلودگی متقاطع بین نمونه‌ها، آلودگی معرف‌ها، انتقال محصول واکنش‌های قبلی، تفسیر نادرست سیگنال ضعیف و طراحی غیراختصاصی پرایمر یا پروب می‌توانند باعث ایجاد نتیجه مثبت کاذب شوند.

ظرفیت نمونه، تعداد کانال‌های فلورسنت، دامنه دمایی، یکنواختی حرارتی، سرعت تغییر دما، نوع مصرفی سازگار، امکانات نرم‌افزاری، قابلیت اتصال به شبکه یا LIS، خدمات پس از فروش، کالیبراسیون، تأمین قطعات و پشتیبانی فنی باید پیش از خرید بررسی شوند.